Mikroskopie pro každého pivovarníka
Vojtěch Hudzieczek
Článek vyšel v časopise Pivař 7 / 2020
Často se při přípravě receptu setkáme s pojmy jako zákvasná dávka (pitching rate), tedy množství buněk kvasnic, které je potřeba pro zakvašení konkrétní mladiny. Takové množství buněk lze jednoduše vypočítat podle vzorce (Pivařka str. 307) ale často je nutné buňky namnožit pomocí startéru (Pivařka str. 313). Existuje velké množství webových kalkulaček, které nám exaktně stanoví množství buněk a potřebnou velikost startéru (i vícekrokového) při daném způsobu provzdušnění. Problém ovšem nastává ještě před vlastním výpočtem a to v momentě, kdy máte do kalkulačky zadat počet buněk. Tato informace je většinou získána odhadem a zejména u tekutých kultur nemusí ani zdaleka odpovídat pravdě. V tomto článku se dozvíte jak na počítání buněk, co je k tomu potřeba a jak stanovit životaschopnost (viabilitu) kvasinek, což uplatníte nejen při zakládání startéru ale také např. při ověření kvality kvasnic, které jste posbírali z nedávné várky a nejste si jisti, zda je použít.
Inspiraci pro napsání tohoto článku jsem dostal ve chvíli, kdy jsem dceři koupil na Aliexpressu velmi levný dětský mikroskop. Po prohlédnutí několika základních preparátů a zjištění, že plastová hračka za cca 200 Kč umí i 400x zvětšení, mě hned ponouklo k vyzkoušení mikroskopování pivních kvasinek. To se podařilo, a proto jsem objednal z Číny i velmi levnou počítací komůrku značky Qiujing, která je ke stanovení počtu kvasnic v roztoku rovněž potřebná. Pár týdnů na to, jsem se rozhodl dětský mikroskop a počítací komůrku prověřit ve srovnávacím testu s profesionálním nádobíčkem (Obrázek 1 a 2).
Počítací komůrka je vlastně podložní sklíčko pro mikroskopii (Obrázek 2), do kterého je vyryta tenká mřížka, která vytváří čtverce o známé ploše (u mřížky Qiujing je plocha tzv. „žlutého čtverce“ 0,04mm2). Tato mřížka je poté přikryta krycím sklíčkem, které dosedne na mřížku tak, že vzdálenost mezi mřížkou a krycím sklíčkem je 0,1mm. Při počítání jednotlivých kvasinek můžeme tedy toto číslo vztáhnout na konkrétní objem (zde tedy 0,004 mm3, což jsou 4 nL) a podle toho přepočítat, kolik kvasinkových buněk se celkem v kultuře nachází.
Pro účely testu jsem použil asi dva týdny starou kulturu WLP001 (California Ale), pro srovnání mikroskop Olympus CX43 a Bürkerovu komůrku německé provenience (Marienfeld). Kulturu jsem obarvil 0,01% methylenovou modří (lze zakoupit v akvaristických potřebách) kvůli detekci neživotaschopných kvasinek. Mrtvé kvasinky se zbarví temně modře, zatímco živé zůstanou čiré. Při počítání buněk jsem použil obě počítací komůrky v obou mikroskopech a spočítal každou variantu v deseti opakováních. Výsledky můžete vidět v grafu (Obrázek 3).
Z výsledků je patrné, že všechny kombinace mikroskopů a komůrek dávají přibližně stejný výsledek a proto není problém použít tyto produkty z Aliexpress pro počítání kvasnic. Výsledný verdikt pro počítací komůrku je velmi pozitivní – v podstatě zde nelze nic vytknout. S mikroskopem je to složitější. Pro počítání kvasinek použít lze, ale práce s ním je opravdu nekomfortní. Zaostření je potřeba ladit dlouho a zároveň se při sebemenším pohybu obraz rozostří, což se bohužel stává dost často i proto, že konstrukce mikroskopu je velmi subtilní a pohnout s ním je velmi lehké. Na druhou stranu, když si představím, jak často potřebuje běžný domovarník počítat kvasnice, není to vzhledem k ceně úplně špatné řešení. Pokud bych pořizoval mikroskop, tak bych volil o něco dražší variantu (já původně kupoval co nejlevnější mikroskop pro účely dětského hraní), kde bude lepší optika a robustnější provedení těla. Za solidní cenu lze dnes koupit i digitální mikroskopy s dobrým zvětšením a malým LCD displejem místo okulárů, z vlastní zkušenosti vím, že mikroskopování s nimi je mnohem pohodlnější.
Závěrem tedy konstatuji, že pro počítání kvasinek v domácím prostředí není potřeba příliš drahé vybavení a stanovení počtu kvasinek v kultuře je možné provádět z pohodlí vašeho domova.
Jak počítat kvasnice
Tekutou kulturu protřepeme/zamícháme tak, abychom získali co nejvíc homogenní roztok (rozhodně by v něm neměly plavat viditelné shluky kvasnic). Odlejeme si malé množství (objem cca 5mL) do čisté nádobky. Ideálním způsobem jak odměřovat takto nízké objemy je umístit nádobu na váhu, a počítat 1 ml jako 1 gram. Od této chvíle není nutné pracovat sterilně, ale doporučuji dodržovat alespoň elementární čistotu. Do kultury přilijeme 5ml methylenové modři (1% roztok - možno zakoupit např. ZDE), takto vzniklou směs znovu pořádně promícháme, roztok doplníme na 50ml (50g) necháme asi 5 minut odstát. Kapátkem naneseme malé množství směsi na počítací komůrku – do míst, kde jsou ve skle rýhy vytvářející mřížku a pomalu přiklopíme krycím sklíčkem. Počítací komůrku umístíme do mikroskopu a odhadneme počet buněk ve „žlutém“ čtverci (viz obrázek4) – mělo bych jich být alespoň 20-30. V případě, že je buněk mnohem víc, tak můžeme roztok znovu naředit a naneseme znova na počítací komůrku. Buňky běžně počítáme z levého horního rohu směrem doprava a na konci čtverce pokračujeme dolů a dále směrem doleva (viz obrázek 4). Spočítáme všech 16 malých čtverců uvnitř žlutého čtverce s červeným rámečkem. Modré buňky počítáme zvlášť; buňky dotýkající se okraje velkého čtverce spočítáme pouze ze dvou stran. Takto stanovíme počet buněk alespoň v 5 velkých čtvercích. Součet životaschopných buněk (neobarvené modře) podělíme součtem všech buněk a vynásobíme 100. Získáme tak procento životaschopnosti (v běžných pivovarských provozech se procento životaschopnosti pohybuje ≥95%). Při stanovení celkového počtu životaschopných buněk nejdříve součet neobarvených buněk vynásobíme 50000x a poté tento výsledek násobíme ředěním a získáme tak počet životaschopných buněk v 1ml původní tekuté kultury. Pokud jste postupovali podle tohoto navodu, tak nasobíme ředěním 10x (5 ml kultury jsme naředili na 50 ml).
